Merkmale der Reaktion auf subchronisches Tief

Sep 19, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 11890 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Kupfer ist ein essentielles Spurenelement für die menschliche Gesundheit und gleichzeitig ein wichtiges Industriemetall, das sowohl in elementarer Form als auch in Verbindungen weit verbreitet ist. Wir führten eine dosisabhängige Bewertung der Reaktion männlicher Outbred-Albino-Ratten auf eine subchronische niedrig dosierte Exposition gegenüber Kupferoxid-Nanopartikeln durch, die intraperitoneal in kumulativen Dosen von 18 bzw. 36 mg/kg über 6 Wochen an die Expositionsgruppen 1 bzw. 2 verabreicht wurden. Wir beobachteten bei den exponierten Tieren Störungen auf verschiedenen Ebenen der Körperorganisation, von molekular bis organisatorisch. Die beobachtete Abnahme der Aktivität der Succinatdehydrogenase in kernhaltigen Blutzellen gab Hinweise auf beeinträchtigte bioenergetische Prozesse. Angesichts der Ergebnisse der Metabolomics-Analyse gehen wir von einer mitochondrialen Schädigung und einem Beitrag apoptotischer Prozesse zur Pathologie durch Kupfervergiftung aus. Wir gehen auch von neurodegenerativen Effekten aus, die auf den ermittelten morphologischen Parametern des Nervensystems, den Ergebnissen von Verhaltenstests und einer verminderten Expression von Genen, die für NMDA-Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus kodieren, basieren. Die hepatotoxische Wirkung, die durch eine Reihe metabolomischer, biochemischer und zytologischer Indikatoren festgestellt wurde, zeigte sich in einer beeinträchtigten Proteinsynthesefunktion der Leber und verstärkten degenerativen Prozessen in ihren Zellen. Wir beobachteten auch eine nephrotoxische Wirkung von Kupferoxid in Nanogröße mit einer vorherrschenden Schädigung der proximalen Nierentubuli. Gleichzeitig zeigten beide getesteten Dosen so positive Auswirkungen auf die Gesundheit wie eine statistisch signifikante Abnahme der Aktivität der alkalischen Phosphatase und des DNA-Fragmentierungsfaktors kernhaltiger Blutzellen. Den beobachteten Veränderungen nach zu urteilen, entspricht die kumulative Dosis von 18 mg/kg Körpergewicht intraperitoneal verabreichten Kupferoxid-Nanopartikeln in etwa dem Schwellenwert für Ratten. Die etablierten Marker für gesundheitliche Beeinträchtigungen können als Ausgangspunkt für die Entwicklung von Techniken zur Früherkennung von Kupfervergiftungen dienen.

Kupfer ist ein essentielles Spurenelement1. Gleichzeitig gibt es in der wissenschaftlichen Literatur eine Fülle von Informationen über mögliche Mechanismen seiner schädlichen Wirkung auf Mikroorganismen2,3, Warmblüter4 und menschliche Zellen5. Kupfernanopartikel zeigen auch ihre toxischen Eigenschaften, die bereits durch zahlreiche In-vitro-Experimente an menschlichen Zellen6,7,8 und Tieren9 sowie in In-vivo-Studien an Warmblütern wie Mäusen10 und Ratten11,12,13 nachgewiesen wurden. Es hat sich gezeigt, dass Nanopartikel aus Kupfer eine stärkere toxische Wirkung haben als seine Mikropartikel14.

Anreddy (2018) berichtete, dass Kupferoxid-Nanopartikel (CuO-NPs), die Wistar-Ratten in Dosen von 5 und 50 mg/kg Körpergewicht pro Tag über 14 Tage verabreicht wurden, signifikante dosisabhängige Veränderungen der antioxidativen Enzymaktivitäten verursachten. Die Ergebnisse zeigten eindeutig eine statistische „Abnahme der Glutathion-, Katalase- und Superoxiddismutase-Aktivität, während die Lipidperoxidationsproduktspiegel erhöht waren“. Der Autor kam zu dem Schluss, dass die orale Exposition gegenüber CuO-NPs eine erhebliche Lebertoxizität verursachte, die möglicherweise auf oxidativen Stress zurückzuführen ist15. Abdelazeim et al. (2020) beobachteten „einen deutlichen Anstieg der Leberenzyme, eine Veränderung des Oxidationsmittel-Antioxidantien-Gleichgewichts und einen Anstieg des hepatischen Entzündungsmarkers“ nach zweiwöchiger Verabreichung einer täglichen oralen Dosis von 100 mg/kg CuO-Nanopartikeln an Ratten16. Die orale Exposition gegenüber CuO-NPs an fünf aufeinanderfolgenden Tagen in Dosen von 32, 64 und 512 mg/kg Körpergewicht pro Tag „führte zu Veränderungen der hämatologischen Parameter sowie klinisch-chemischer Marker.“ Außerdem „wurden histopathologische Veränderungen im Knochenmark, im Magen und in der Leber beobachtet, die hauptsächlich aus einer Entzündungsreaktion, Geschwürbildung und Degeneration bestanden“17. Die subchronische intraperitoneale Exposition von Ratten gegenüber CuO-NPs in einer Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht veränderte „viele funktionelle und biochemische Indikatoren für den Status des Organismus sowie pathologische Veränderungen von Leber, Milz, Nieren und Gehirn“ und führte zu einer Zunahme von der DNA-Fragmentierungsfaktor12. Mithilfe histopathologischer und immunhistochemischer Methoden konnten Ghonimi et al. (2022) nach intraperitonealer Injektion von CuO-NPs mit Dosen von 5, 10 und 25 mg degenerative Veränderungen in Leber und Nieren bis hin zu „schwerer Hepatozytennekrose mit vollständiger Desorganisation der Leberstrahlen“ nachweisen /kg Körpergewicht/Tag für 9 Tage18.

In vielen Branchen kommt es zu einer Exposition des Menschen gegenüber Kupfernanopartikeln, darunter in der Druckindustrie und bei der Herstellung von Lithium-Ionen-Batterien19. Neben der offensichtlichen gezielten Verwendung dieser Nanopartikel ist bekannt, dass pyrometallurgische Prozesse zusammengesetzte Aerosole erzeugen, bei denen Partikel im Nanometerbereich überwiegen20. Dies wurde bereits durch eigene Untersuchungen am Beispiel der Größenverteilung von Partikeln bestätigt, die auf einem Membranfilter aus der Luft am Arbeitsplatz beim Erschmelzen von Blistern21 und raffiniertem12 Kupfer gesammelt wurden.

Der aktuelle Trend zu reduzierten Emissionen industrieller Schadstoffe durch Verbesserung technologischer Prozesse und eine bessere Effizienz bestehender und neu installierter Luftfiltersysteme erfordert die Prüfung der gesundheitlichen Auswirkungen niedriger Kupferkonzentrationen in toxikologischen Experimenten.

Veränderungen der integralen Indikatoren der allgemeinen toxischen Wirkung der Exposition gegenüber Kupferoxid-Nanopartikeln waren dosisabhängig (Tabelle 1). Die Dauer des ersten Eintritts in die dunkle Kammer im Hell-Dunkel-Box-Test verringerte sich, während der Summationsschwellenindex, der die Fähigkeit des Nervensystems beschreibt, unterhalb der Schwelle liegende Impulse zu summieren, zunahm. Es wurden keine Veränderungen des Körpergewichts der Tiere oder ihrer Organe (in g/100 Körpergewicht) registriert.

Unter der Wirkung von Kupferoxid-Nanopartikeln zeigte die Aktivität der Succinat-Dehydrogenase (SDH) in Blutlymphozyten in beiden Expositionsgruppen einen statistischen Rückgang, während der Thrombozytenkrit einen dosisabhängigen Anstieg zeigte und die absolute Thrombozytenzahl tendenziell mit zunehmender Dosis an CuO-NPs zunahm.

Wir beobachteten Veränderungen der biochemischen Blutserumparameter, darunter eine Abnahme des Albumin/Globulin-Verhältnisses aufgrund einer Abnahme der absoluten Albuminzahl und eines leichten Anstiegs der Globuline, eine Abnahme der Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) und eine erhöhte Aktivität der Alaninaminotransferase (ALT).

Dosisabhängige Veränderungen im Verhältnis bestimmter Zelltypen in Abdruckabstrichen von Leber und Nieren nach Verabreichung verschiedener Dosen von Kupferoxid-Nanopartikeln sind in Tabelle 2 dargestellt. Wir beobachteten eine erhöhte Anzahl degenerierter Hepatozyten in der Leber sowie degenerierte Zellen im proximalen und distalen Bereich Tubuli und Eosinophile in den Nieren.

Von drei Tieren jeder Expositionsgruppe (n = 6) wurden Proben entnommen. Wir untersuchten 108 elektronenmikroskopische Aufnahmen der Leber.

Die Analyse der Morphotyp-Zusammensetzung von Mitochondrien in Rattenleberzellen zeigte Unterschiede zwischen der Versuchs- und der Kontrollgruppe (Pearson-Chi-Quadrat-Test χ2 (4; 0,05) = 10,5; p = 0,033) (Abb. 1).

Beispiele typischer STEM-Bilder normaler (a), normaler vesikulärer (b), vesikulärer (c), geschwollener vesikulärer (d) und geschwollener (e) mitochondrialer Morphotypen, die in Geweben der Kontrolltiere und Ratten der Expositionsgruppe 2 gefunden wurden, die CuO-NPs erhielten bei einer kumulativen Dosis von 36 mg/kg Körpergewicht.

Der Pearson-Chi-Quadrat-Anpassungstest (χ2) verglich jedoch die Verteilung der mittleren Gruppenwerte unabhängig von ihrer gruppeninternen Variabilität. Der paarweise Vergleich des prozentualen Anteils jedes Morphotyps in der Expositions- und Kontrollgruppe zeigte keine signifikanten Unterschiede im Mann-Whitney-U-Test (Tabelle 3).

Daher stellten wir eine Tendenz zur Manifestation von Zytotoxizität auf der Ebene der mitochondrialen Ultrastruktur fest, nämlich: eine leichte Abnahme des Anteils normaler und eine Zunahme geschädigter Mitochondrien im gesamten Spektrum mit Ausnahme der vesikulär geschwollenen.

Die Ergebnisse der Hauptkomponentenanalyse zeigten, dass es in der Kontrollgruppe keine Probenclusterung gab. Die beobachtete Divergenz der Proben in den Expositionsgruppen war dosisabhängig (Abb. 2). Darüber hinaus zeigte der Student-T-Test, dass die Anzahl der Metaboliten, die ihren Gehalt signifikant veränderten, in der zweiten Expositionsgruppe (höhere Dosis) signifikant höher war.

Ergebnisse der HPLC-MS-Datenanalyse von Blutprobenspektren mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (● vor und ♦ nach der Exposition).

Die statistische Analyse der Daten mithilfe der Hauptkomponentenmethode und des mehrfach vergleichsbereinigten t-Tests in der Mass Profiler Professional-Software ergab statistisch signifikante Veränderungen in beiden Expositionsgruppen (Abb. 3).

(a) Ein Vulkandiagramm der t-Test-Ergebnisse: Die mit roten und blauen Quadraten markierten Substanzen zeigten nach der Exposition eine statistische Konzentrationsänderung; (b) die Anzahl der Stoffe mit der geänderten Konzentration in den Expositionsgruppen, die aus dem t-Test ermittelt wurden, angepasst für mehrere Vergleiche.

Nur ein Teil der ausgewählten Substanzen hatte eine ausreichende Intensität des analytischen Signals, um aussagekräftige Fragmentspektren zu erhalten, sodass die Annotation nicht für alle Metaboliten in den Gruppen möglich war. Tabelle 4 zeigt die Liste der kommentierten Metaboliten.

Die Veränderungen waren wahrscheinlich dosisabhängig. Der Gehalt an Lysophosphatidylcholinen (LPC) nahm ab, während der von LPE, Lysophosphatidylinositolen (LPI) und Lysophosphatidylserin (LPS) anstieg. Der Gehalt an Monoglyceriden und Palmitinsäure nahm ab, während der Gehalt an Methylhexadecansäure und Methyllinoleat anstieg.

Beide getesteten Dosen verringerten den DNA-Fragmentierungsfaktor in kernhaltigen Blutzellen statistisch auf 0,398725 + 0,000357 in Expositionsgruppe 1 und auf 0,399505 + 0,000215 in Expositionsgruppe 2 gegenüber 0,425771 + 2,24E-05 in den Kontrollen, p < 0,05.

Tabelle 5 zeigt Daten zu genetischen Veränderungen bei den exponierten Tieren. Die höchste der getesteten Dosen verursachte eine Abnahme der Expression des GRIN1-Gens im Hippocampus der Versuchsratten, während die Expression der GRIN2A- und GRIN2B-Gene einen dosisabhängigen Rückgang zeigte.

Wir haben bereits die subchronische Toxizität von CuO-Nanopartikeln nach wiederholten intraperitonealen Injektionen bei Ratten in Dosen von 10 mg/kg Körpergewicht.12 und 2,5 mg/kg Körpergewicht.13 pro Tag untersucht. In der Studie mit einer hohen Kupferdosis beobachteten wir hämatologische und biochemische Veränderungen im Blut, histologische Veränderungen in Leber und Nieren, eine Ansammlung von Kupfer in den Nieren und neurodegenerative Störungen. Nachfolgende Experimente mit einer niedrigeren Dosis zeigten einen Rückgang spezifischer Manifestationen einer Kupfervergiftung. Die für diese Studie gewählten Dosen sind im Hinblick auf die Suche nach subtileren Veränderungen auf Metabolom- und Genomebene, die durch Kupferoxid-Nanopartikel hervorgerufen werden, interessant.

Mitochondrien sind bekannte Ziele für fast alle Arten von schädlichen Stoffen, einschließlich Toxinen22 und oxidativem Stress23. Es wurde über eine Veränderung des Potenzials der Mitochondrienmembran unter der Wirkung von Kupfernanopartikeln berichtet6. Mitochondriale Dysfunktionen sind oft schwer zu messen und zu beweisen24; Dennoch lässt sich dies anhand von Veränderungen in bestimmten Markern vermuten.

Succinatdehydrogenase (SDH) ist ein mitochondriales Enzym, das an seiner inneren Membran befestigt ist. Es ist am Tricarbonsäurezyklus und der Elektronentransportkette in Mitochondrien beteiligt, indem es diese beiden Prozesse verknüpft25. Eine SDH-Dysfunktion ist in der medizinischen Praxis von großer Bedeutung, da sie ein breites Spektrum an Störungen verursacht: von neurogenerativ26 bis hin zu krebserregend27,28, indem sie die Funktion der Mitochondrien stört und das bioenergetische Potenzial der Zelle verringert.

Die Exposition gegenüber CuO-Nanopartikeln führte zu einem Rückgang des SDH in den Expositionsgruppen 1 und 2 um 11,95 % bzw. 11,64 %. In unseren vorherigen Experimenten haben wir außerdem einen Rückgang der Aktivität dieses Enzyms um 20,72 % bei einer Einzeldosis von 2,5 mg/kg13 und um 12,23 % bei einer Einzeldosis von 10 mg/kg12 registriert.

Basierend auf der Annahme, dass funktionelle Veränderungen in Mitochondrien im Zusammenhang mit ihrer Störung durch Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden können, suchten wir nach Veränderungen auf subzellulärer Ebene. Eine Ultrastrukturstudie der Leber zeigte einen Rückgang des Anteils normaler Typ-A-Mitochondrien. Gleichzeitig wurde ein solcher Effekt für die Summe der Typen A und B nicht beobachtet, die beide auf normal funktionierende Mitochondrien zurückzuführen sind.

Die Funktionen von Mitochondrien sind vielfältig; Dazu gehören die oxidative Phosphorylierung zur Produktion von zellulärem Adenosintriphosphat (ATP), die Beteiligung an der Ionenhomöostase, einige Stoffwechselwege, der programmierte Zelltod sowie die Produktion und der Verbrauch reaktiver Sauerstoffspezies29. Veränderungen in Mitochondrien, die zelluläre „Energiestationen“ darstellen, sind wichtig für die spätere Entstehung pathologischer Zustände von Organen und Systemen sowie des gesamten Organismus.

Die metabolomics-basierten Blutuntersuchungen der exponierten Tiere zeigten einen relativ geringen Anstieg des Spiegels von Lysophosphatidylserin (LPS (20:4)), einem Metaboliten, der Entzündungsprozesse auslöst und als Signalstoff bei der Aufnahme apoptotischer Zellen fungiert durch Makrophagen30. Dieser Befund könnte sowohl auf den Entzündungsprozess als auch auf eine verstärkte Apoptose bei den exponierten Tieren hinweisen.

Wenn der Entzündungsprozess tatsächlich vorliegt, ist er offenbar äußerst unbedeutend, da die allgemeinen Blutuntersuchungsergebnisse keine statistischen Unterschiede zwischen den Fällen und den Kontrollen hinsichtlich der Entzündungsprozesse zeigten, mit Ausnahme der Thrombozytenzahl (Tabelle 1). Blutplättchen dienen als wichtige Verbindung zwischen dem Gerinnungs- und dem Immunsystem 31. Ein statistisch signifikanter Anstieg des Blutplättchenkrits und ein Trend zu einem Anstieg der Blutplättchenzahl können auf eine Entzündung hinweisen, die mit der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zusammenhängt, die durch die Exposition gegenüber CuO hervorgerufen wird NPs32,33. ROS wiederum sind Mediatoren der Aktivierung des Immunsystems34. Ein leichter Anstieg des Globulinspiegels in der Expositionsgruppe 2 war aus dem gleichen Grund wahrscheinlich aufgrund eines Anstiegs der Fraktionen von Alpha-1-Globulin und Beta-Globulin.

Ein 1,8-facher Anstieg der Eosinophilenzahl weist indirekt auf die Fähigkeit von nanoskaligem Kupferoxid hin, immunkompetente Zellen zu stimulieren, wie von Tulinska et al.35 gezeigt.

In Anbetracht des oben Gesagten gehen wir davon aus, dass apoptotische Veränderungen zur sich entwickelnden Pathologie beitragen. Abgesehen vom Anstieg des Lysophosphatidylserin-Spiegels wurde die Apoptose durch eine Abnahme des Anteils normaler Mitochondrien und einen Anstieg aller Arten geschädigter Mitochondrien mit Ausnahme der vesikulär geschwollenen Mitochondrien nachgewiesen (Tabelle 3). Daten zur Topologie der Innenmembran korrelierten mit dem physiologischen Zustand der Mitochondrien im Verlauf des Zelltods, also mit dem Verlust des Potenzials der Mitochondrienmembran, der mit einer Freisetzung von Cytochrom einhergehen könnte. Wir stellten fest, dass die vesikuläre Konfiguration mit der Freisetzung von Proteinen und Cytochrom verbunden ist36,37. Ein weiterer Übergang der Mitochondrien in die geschwollene Konfiguration erfolgt erst nach dem Potenzialverlust der Mitochondrienmembran, lange Zeit nach der Freisetzung von Cytochrom38.

Mitochondrien sind eine der Schlüsselkomponenten der Apoptose in Säugetierzellen39. Ein Zusammenhang zwischen abnormaler Apoptose und bestimmten Krankheiten, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen (Alzheimer-, Huntington- und Parkinson-Krankheit, die durch übermäßige Apoptose von Neuronen gekennzeichnet sind), wurde inzwischen festgestellt40.

Ionotrope Glutamat-NMDA-Rezeptoren sind für die schnelle synaptische Übertragung verantwortlich und spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Dauer des erregenden Potenzials41,42. In Kombination mit einer Abnahme des Gehirngewichts kann man bei den exponierten Tieren von neurodegenerativen Zuständen ausgehen (Tabelle 5).

Diese Vermutung wurde durch die Ergebnisse von Verhaltenstests bestätigt: Ein steigender Summationsschwellenindex deutete auf das Überwiegen hemmender Prozesse im Nervensystem hin43. Ein erhöhtes Angstniveau im Zusammenhang mit der Nanopartikel-Exposition wurde anhand einer Verkürzung der Dauer des ersten Betretens der dunklen Kammer im Hell-Dunkel-Box-Test beurteilt18,19.

Wir haben auch Anzeichen einer Leberschädigung gefunden, die vermutlich durch übermäßige Apoptose verursacht wird. Das Metabolomics-Screening zeigte einen Rückgang des Lysophosphatidylcholinspiegels, der zuvor nach der Exposition gegenüber Ionen einiger Schwermetalle, einschließlich Kupfer, festgestellt wurde44,45. Da diese Substanzen in der Leber synthetisiert werden, kann ein Rückgang ihrer Blutspiegel auf eine beeinträchtigte Synthesefunktion dieses Organs im Zusammenhang mit LPC zurückgeführt werden. Diese Beeinträchtigung wurde auch durch ein niedrigeres Verhältnis von Albumin zu Globulin aufgrund einer geringeren Albuminzahl nachgewiesen, die entweder auf die Unterdrückung seiner Synthese oder seine erhöhten Verluste zurückzuführen ist, was durch eine mit Proteinurie einhergehende Nierenerkrankung veranschaulicht wird 46. Dennoch stellten wir einen Rückgang des Spiegels fest Gesamtprotein im Urin, was auf eine gewisse Unterdrückung der Albuminsynthese in der Leber unter der Wirkung von CuO NP-Exposition (bei einer Dosis von 2 mg/kg) hindeutet. Wir haben an anderer Stelle eine ähnliche Unterdrückung der Proteinsynthesefunktion nach der Exposition gegenüber CuO-NPs in einer Einzeldosis von 2,5 mg/kg beschrieben13.

Wir stellten in der zweiten Expositionsgruppe bei einer Einzeldosis von 2 mg/kg einen signifikanten Rückgang der Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) fest. Wir beobachteten einen ähnlichen Effekt der Exposition gegenüber CuO-NPs bei einer Einzeldosis von 2,5 mg/kg13, jedoch nicht bei 10 mg/kg12; außerdem handelt es sich um ein klassisches Symptom der Wilson-Krankheit, einem angeborenen Defekt des Kupferstoffwechsels, der zu dessen Akkumulation führt47. Eine geringere AP-Aktivität ist mit Zink- und Magnesiummangel verbunden, da beide Metalle Teil dieses Enzyms sind48. Bei einer subchronischen Exposition gegenüber ZnO-NPs13 wurde jedoch eine beeinträchtigte AP-Aktivität beobachtet, was es uns ermöglicht, eine Schlüsselrolle des Zink-zu-Magnesium-Verhältnisses bei der AP-Aktivität anzunehmen. Weitere Studien sind erforderlich, um die Ursachen und Mechanismen der verminderten Aktivität der alkalischen Phosphatase zu klären.

Eine Veränderung der sekretorischen Funktion der Leber zeigte sich auch in einer (im Vergleich zu den Kontrollen) geringeren Anzahl an Triglycerid-Spaltungsprodukten, also den Monoglyceriden MG(16:0) und MG(18:0), Palmitinsäure, sowie einer höheren Gehalt an Estern der Hexadecan- und Linolsäure. Triglyceride und Fettsäureester werden durch die in diesem Organ synthetisierte Leberlipase gespalten und in den Blutkreislauf freigesetzt; Infolgedessen wird eine Verringerung der Sekretion dieses Enzyms erwartet, was auch durch einen Anstieg des Lysophosphatidylethanolamin-LPE(20:4)-Spiegels gestützt wird, dessen direkte Wirkung auf Leberzellen die Expression von Genen hemmt, die dafür verantwortlich sind Synthese von Lipasen49. Gleichzeitig unterschieden sich die Indikatoren des Blutfettprofils der exponierten Tiere (Triglyceride, Cholesterin, Lipoproteine ​​niedriger und hoher Dichte) nicht signifikant von denen der Kontrollen.

Die Aktivität der Alanin-Aminotransferase (ALT) hat sich verändert, was ebenfalls auf eine Leberschädigung in den exponierten Gruppen hinweisen kann. Veränderungen auf molekularer Ebene und in biochemischen Blutparametern wurden durch zytologische Veränderungen gestützt: Nach der Exposition gegenüber Kupferoxid-Nanopartikeln stieg die Anzahl degenerierter Hepatozyten in Abstrichabstrichen der Leber an (Tabelle 2), ähnlich wie der Anteil prokaryotischer Leberzellen (Abb. 4C). Darüber hinaus beobachteten wir bei den exponierten Tieren im Vergleich zu den Kontrollen (Abb. 4A) deutliche dystrophische und nekrobiotische Veränderungen in den Hepatozyten (Abb. 4B).

Ergebnisse einer histologischen Untersuchung der Versuchstiere: (A) Leber, Kontrollgruppe: normale Leberstruktur, 100-fache Vergrößerung; (B) Leber, Expositionsgruppe 2: ausgeprägte dystrophische und nekrobiotische Veränderungen in Hepatozyten, 100-fache Vergrößerung; (C) die erhöhte Anzahl prokaryotischer Hepatozyten, %, * p < 0,05 im Vergleich zu Kontrollen; (D) Nieren, Kontrollgruppe: Das Epithel der gewundenen Tubuli der Nieren mit einem klaren PAS-positiven Bürstensaum am apikalen Rand, das Zytoplasma ist homogen, die Kerne sind gut sichtbar, die Lumen der Tubuli sind nicht erweitert, 100 × Vergrößerung; (E): Nieren, Expositionsgruppe 2: Zerstörungsherde des PAS-positiven Bürstensaums des tubulären Epithels, dystrophische Veränderungen im Zytoplasma, tubuläre Lumendilatation, 100-fache Vergrößerung; (F) Verlust des Bürstensaums des Nierenröhrenepithels, %, * p < 0,05 im Vergleich zu Kontrollen.

Die nephrotoxische Wirkung von CuO-NPs wurde anhand des zytologischen Bildes von Nierenabdruckabstrichen analysiert (Tabelle 2). Es ist bekannt, dass proximale Tubuli aufgrund einer unterschiedlichen funktionellen Belastung dieser Teile stärker geschädigt werden als distale. Nach unseren in Tabelle 2 dargestellten und an anderer Stelle beschriebenen Erkenntnissen51 ist diese Aussage auch für die Auswirkungen von Nanopartikeln relevant.

In den Abdruckabstrichen der Nieren wurde in beiden Expositionsgruppen ein statistisch signifikanter Anstieg der Eosinophilenzahl beobachtet. Unsere Ergebnisse stimmen mit den von Cho et al.52 veröffentlichten Ergebnissen überein und weisen auf die Fähigkeit von Kupferoxid-Nanopartikeln hin, Entzündungen mit Beteiligung von Eosinophilen auszulösen. Erwähnenswert ist die potenzielle Rolle von Eosinophilen bei der zusätzlichen Schädigung von Nierenzellen: Aktivierte Eosinophile können oxidativen Stress auslösen, der zum Zelltod führt53.

Histologisch beobachteten wir im Vergleich zu den Kontrollen (Abb. 4D) so ausgeprägte morphologische Veränderungen wie Dystrophie der Nierenzellen, tubuläre Lumendilatation und Herde der Zerstörung des PAS-positiven Bürstensaums des tubulären Epithels (Abb. 4E). Die morphometrische Analyse zeigte den Verlust des Bürstensaums des Nierenröhrenepithels (Abb. 4F).

Zuvor wurde die Wirkung der subchronischen Toxizität von nanoskaligem Kupferoxid auf genetischer Ebene nachgewiesen, die sich in einem leichten, aber statistisch signifikanten Anstieg des genomischen DNA-Fragmentierungsfaktors um 7,58 % in Leberzellen, um 24,66 % in Milzzellen 12 und um 2,12 äußerte % in kernhaltigen Blutzellen von Ratten13 im Vergleich zu den Kontrollen. Die Fähigkeit von nanoskaligem Kupferoxid, die DNA zu schädigen, wurde auch durch andere Studien bestätigt. An der HUVEC-Zellkultur wurde beispielsweise gezeigt, dass aus nanoskaligem Kupferoxid freigesetzte Kupferionen oxidativen Stress und die Aktivierung des p38-MAPK-Signalwegs induzieren und anschließend DNA-Schäden und Zelltod verursachen können33. Ihre Antikrebsaktivität steht auch in engem Zusammenhang mit der ROS-Erzeugung54.

Vor dem Hintergrund einer umfangreichen Evidenzbasis erscheint es paradox, dass, im Gegensatz zu dem von uns fast immer beobachteten Anstieg des genomischen DNA-Fragmentierungsfaktors in Experimenten mit Nanopartikeln verschiedener Metalloxide, einschließlich denen von CuO12,13, in der vorliegenden Studie Bei Letzterem beobachten wir eher eine schützende Wirkung. Dieser Effekt kann dadurch bestimmt werden, dass die moderne Toxikologie neben klassischen Abhängigkeiten auch Hinweise auf nichtlineare Muster der Dosis-Wirkungs-Beziehung gesammelt hat. Laut Erofeeva (2014) waren unter der Wirkung verschiedener Schadstoffe, darunter Schwermetalle, die meisten (85,7 %) der Dosis-Wirkungs-Beziehungen präzise nichtlinear. Gleichzeitig wurde in 5,5 % der Fälle Hormesis festgestellt, während es sich bei den übrigen 94,5 % um paradoxe Effekte handelte, bei denen mehrphasige Abhängigkeiten ähnlich den Schwingungsabhängigkeiten vorherrschten55.

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine subchronische Exposition gegenüber Kupferoxid-Nanopartikeln in Dosen von 1 und 2 mg/kg Körpergewicht, die dreimal wöchentlich über einen Zeitraum von 6 Wochen instilliert werden, eine toxische Wirkung auf systemischer und organismischer Ebene hat, wenn auch nicht immer dosisabhängig.

Wir zeigten dosisabhängige Veränderungen bei den Ratten bei der Beurteilung der Intensität zellulärer Energieprozesse, der Verhaltensreaktion bei Ratten, die sich in der Dominanz hemmender Prozesse und einem höheren Angstniveau äußerte, und des Thrombozytenkrits.

Die hepatotoxische Wirkung, die durch eine Reihe metabolomischer, biochemischer und zytologischer Indikatoren festgestellt wurde, zeigte sich in einer beeinträchtigten Proteinsynthesefunktion der Leber und verstärkten degenerativen Prozessen in ihren Zellen. Wir beobachteten auch eine nephrotoxische Wirkung von Kupferoxid in Nanogröße mit einer vorherrschenden Schädigung der proximalen Nierentubuli.

Eine Dosis an Kupferoxid-Nanopartikeln von 1 mg/kg Körpergewicht, die 18-mal über einen Zeitraum von 6 Wochen intraperitoneal verabreicht wird, kann als annähernd den Schwellenwert angesehen werden.

Die etablierten Marker für Gesundheitsstörungen können als Ausgangspunkt für die Entwicklung von Techniken zur Früherkennung von Kupfervergiftungen dienen.

Die Suspension aus Kupferoxid-Nanopartikeln wurde an der Uraler Föderalen Universität hergestellt. Wir verwendeten eine gepulste Laserablation von dünnen Metallblechzielen aus 99,99 % reinem Kupfer in sterilem entionisiertem Wasser. Der mittlere Durchmesser der suspendierten Kupferoxid-Nanopartikel betrug 21 ± 4 nm (Abb. 5), wie durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) gezeigt wurde. Die Suspensionsstabilität wurde anhand des Zetapotentials beurteilt, das mit dem Größenanalysator Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical, UK) gemessen wurde. Es wurde festgestellt, dass sie hoch ist (bis zu 42 mV, entionisiertes Wasser), sodass wir die Partikelkonzentration auf 0,25 mg/ erhöhen konnten. mL durch teilweise Wasserverdampfung bei 50 °C, ohne die Größe und chemische Identität der Nanopartikel zu verändern.

(a) Suspendierte Kupferoxid-Nanopartikel (Elektronenmikroskopie bei 100.000-facher Vergrößerung); (b) die Funktion der Partikeldurchmesserverteilung, die zeigt, dass der mittlere Durchmesser von CuO-NPs 21 ± 4 nm betrug.

Die Studie wurde an ausgezüchteten männlichen Albino-Ratten durchgeführt, 12 Tiere in jeder Expositionsgruppe. Das anfängliche Körpergewicht der Tiere betrug 200–270 g, wobei die Schwankung innerhalb von ± 20 % des Durchschnittsgewichts lag. Das Alter der Nagetiere zu Beginn des Experiments betrug 12–14 Wochen, da in dieser subchronischen Toxizitätsstudie vermutlich sehr gefährlicher Nanopartikel Bedenken hinsichtlich einer geringen Überlebensrate junger Erwachsener befürchtet wurden.

Die Ratten wurden in einem speziell ausgestatteten Vivariumraum gemäß den von CIOMS und ICLAS (2012) entwickelten International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals (Internationale Leitprinzipien für biomedizinische Forschung mit Tieren) gehalten. Sie wurden durch schnelle Enthauptung mit Isofluran-Anästhesie eingeschläfert, die zusätzlich zur schmerzlosen Enthauptung eingesetzt wurde. Die Genehmigung der Studie erfolgte durch die lokale Ethikkommission des Medizinischen Forschungszentrums Jekaterinburg für Prophylaxe und Gesundheitsschutz bei Industriearbeitern, Protokoll Nr. 2 vom 20. April 2021.

Die subchronische Toxizität wurde durch wiederholte intraperitoneale Injektionen dreimal wöchentlich über einen Zeitraum von sechs Wochen (insgesamt 18 Instillationen) modelliert. Den Kontrolltieren wurde entionisiertes Wasser injiziert; 2 ml stabile Suspensionen von CuO-Nanopartikeln in Konzentrationen von 0,125 mg/ml und 0,25 mg/ml wurden Tieren der Expositionsgruppe 1 und 2 injiziert, was Einzelexpositionsdosen von 1 und 2 mg/kg und den kumulativen Dosen von 18 und 2 ergibt 36 mg/kg nach jeweils 18 Instillationen.

Die Wahl der Expositionsdosis wurde durch die Ergebnisse einer Literaturrecherche bestimmt, die zeigte, dass eine intraperitoneale Instillation von Kupferoxid-Nanopartikeln in Dosen von 5 bis 25 mg/kg Körpergewicht möglich ist. pro Tag über neun Tage verursachte Leber- und Nierenveränderungen und sogar Gewebenekrose18. Orale Verabreichung von 5 mg/kg KG. Die Gabe von CuO-NPs pro Tag über 14 Tage an Wistar-Ratten führte zu signifikanten Veränderungen der antioxidativen Enzymaktivitäten und der Lebertoxizität15. Außerdem stützten wir uns auf unsere eigenen früheren Erfahrungen, die zeigten, dass 10 mg/kg KG. dieser NPs veränderten verschiedene Indizes des Organismus signifikant12, während 2,5 mg/kg Körpergewicht. hatte keine Wirkung13.

Für eine höhere Genauigkeit bei der individuellen Dosierung wurde der intraperitoneale Verabreichungsweg gewählt.

In der fünften Expositionswoche registrierten wir den Summationsschwellenindex56 und führten einen Hell-Dunkel-Boxtest43,56,57 durch. Nach Beendigung der Exposition untersuchten wir visuell makroskopische Veränderungen in inneren Organen und wogen sie; Wir haben auch biochemische Parameter des Blutserums analysiert. Der bioenergetische Zustand der Ratten wurde durch die Aktivität der Succinatdehydrogenase (SDH) bestimmt, die zytochemisch unter Verwendung von Nitroblau-Tetrazoliumchlorid ermittelt und als Anzahl der Formazan-Körner pro 50 Zellen unter Verwendung optischer Mikroskopie mit Immersionsöl ausgedrückt wurde58. Die Blutparameter wurden mit einem Hämatologieanalysator Mythic 18 bestimmt.

Für die Abdruckzytologie wurden Abdruckabstriche aus Leber- und Nierenquerschnitten angefertigt, bei Raumtemperatur getrocknet und dann mit der Leishman-Färbung gefärbt. Die Zellzusammensetzung und Anzeichen einer Zellschädigung wurden mit einem Carl Zeiss Primo Star-Lichtbinokularmikroskop mit einem USCMOS-Videokamera-Visualisierungssystem bei 100-facher und 1000-facher Vergrößerung analysiert. Bei der Mikroskopie zählten wir 100 Zellen aus jedem Lymphknotenabstrich und 300 Zellen aus Abstrichen anderer Organe.

Histologische Proben wurden hergestellt, indem Nieren und Leber in Formalin getaucht, dann in 2–3 mm dicke Scheiben geschnitten, mit Alkoholen zunehmender Konzentration behandelt und in Paraffin eingebettet wurden. Anschließend wurden 3–4 μm große Schnitte aus den eingebetteten Blöcken geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt; Darüber hinaus wurde auch die Methode der Perjodsäure-Schiff-Färbung für die Nieren angewendet. Die Untersuchung histologischer Präparate, ihrer Mikrofotografie und Morphometrie wurde unter Verwendung des Avtandilov-Augenmessgitters und einer Computersoftware zur Mustererkennung59,60,61 unter Verwendung eines Olympus CX-41-Mikroskops mit einer Olympus Soft Imaging Solution GMBH, einer Kamera des Modells LC20 und einem LCmicro durchgeführt Software. Mindestens 30 Messungen jedes Indikators wurden an Präparaten von vier Nagetieren aus jeder Expositions- und Kontrollgruppe durchgeführt.

Die Zellultrastruktur wurde mittels Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM) beurteilt. Der Grad der Mitochondrienschädigung wurde gemäß der Klassifizierung von Mei G. Sun anhand morphologischer Merkmale wie Matrixraum und Anzahl der Cristae36 bestimmt. In den Berechnungen wurden Mitochondrien der Typen A (normal) und B (normal vesikulär) als normal gezählt, während Mitochondrien der Typen C (vesikulär), D (vesikulär geschwollen) und E (geschwollen) als abnormal galten.

Das metabolische Screening wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS) mit einem Flugzeitmassenspektrometer durchgeführt. Die Rohdaten wurden mit dem Agilent MassHunter-Softwarepaket zur Massenspektrenverarbeitung und Merkmalsextraktion verarbeitet. Die Datenverarbeitung wurde in Mass Profiler Professional durchgeführt; Die statistische Analyse umfasste PCA und gepaarten T-Test. Für jede Expositionsgruppe erhielten wir einen Satz m/z-Werte, deren Intensität sich während des Experiments statistisch änderte. Diese Massen wurden durch exakte Massen- und Fragmentspektrenanalyse unter Verwendung verfügbarer Datenbanken (HMDB, MoNA, METLIN, MassBank EU) und In-silico-Fragmentierungstools (MetFrag, CFM-ID, MS-FINDER) annotiert.

Der Grad der genomischen DNA-Fragmentierung wurde im Zentralen Forschungslabor der Ural State Medical University, Jekaterinburg, Russische Föderation, durch Analyse des verstärkten Fragmentlängenpolymorphismus an Kernzellen des zirkulierenden Blutes, wie an anderer Stelle beschrieben62, bewertet.

Um die Genexpression zu analysieren, wurde ein Teil des Hippocampus der Ratte in IntactRNA fixiert, um die RNA in Bioassays mit der folgenden Phenol/Chloroform-RNA-Extraktion zu stabilisieren. Die quantitative RNA-Analyse wurde mit einem Qubit™ 4 Fluorometer und dem Qubit™ RNA BR Assay Kit durchgeführt. RNA-Proben wurden mit RNase-freier DNase I behandelt, gefolgt von einer reversen Transkriptionsreaktion mit einem MMLV-RT-Kit unter Verwendung eines SimpliAmp™ Thermal Cycler. Die Bestimmung der Expression der Gene GRIN1, GRIN2A und GRIN2B, die für die Proteine ​​GluN1, GluN2A bzw. GluN2B kodieren, wurde durch Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) mit Primern, Sonden63 und einer fertigen Mischung qPCRmix-HS durchgeführt von Evrogen unter Verwendung eines Quant StudioTM 3 RT-PCR-Systems. Der Grad der Genexpression wurde anhand des mRNA-Spiegels des untersuchten Gens im Vergleich zu dem des Referenz-GAPDH-Gens „Housekeeping“ unter Verwendung der Delta-Delta-CT-Methode (ΔΔCt) ermittelt.

Die statistische Signifikanz der Daten zu Verhaltensreaktionen, dem genomischen DNA-Fragmentierungsfaktor und biochemischen Parametern wurde mithilfe des Student-t-Tests (p ≤ 0,05) bewertet. Darüber hinaus verglichen wir p-Werte, die mit dem Student-t-Test und dem Mann-Whitney-Test geschätzt wurden, und ihre allgemeine Übereinstimmung bewies die Angemessenheit der Anwendung des t-Tests.

Die statistische SEM-Datenverarbeitung wurde mit der Statistica-Software von StatSoft durchgeführt. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde mithilfe des Student-T-Tests, des Mann-Whitney-U-Tests und einer ein- und zweifaktoriellen ANOVA bestimmt.

Zur statistischen Verarbeitung von Daten zur Genexpression wurde ein nichtparametrischer Kruskal-Wallis-Test zum paarweisen Vergleich mehrerer Gruppen in der Software Statistica 12 verwendet.

Der Unterschied zwischen den Mittelwerten wurde als statistisch signifikant angesehen, wenn die Wahrscheinlichkeit seines zufälligen Auftretens kleiner oder gleich 0,05 war (p ≤ 0,05).

Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Die Manuskriptberichterstattung richtet sich nach den ARRIVE-Richtlinien für die Berichterstattung über Tierversuche. Die Studie wurde von der Ethikkommission des Medizinischen Forschungszentrums Jekaterinburg für Prophylaxe und Gesundheitsschutz bei Industriearbeitern genehmigt (Protokoll Nr. 2 vom 20. April 2021).

Die in dieser Studie präsentierten Daten sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. Wir danken dem Medizinischen Forschungszentrum Jekaterinburg für Prophylaxe und Gesundheitsschutz bei Industriearbeitern für die Finanzierung der experimentellen Materialien und Einrichtungen. Wir danken dem Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation für die Forschungsförderung (Entwicklungsprogramm der Uraler Föderalen Universität im Rahmen des Prioritätsprogramms 2030) für die Durchführung des Experiments und die Analyse seiner Ergebnisse. Die Autoren möchten den Mitarbeitern des Uraler Zentrums für gemeinsame Nutzung „Moderne Nanotechnologien“ der Uraler Föderalen Universität, benannt nach dem ersten russischen Präsidenten Boris Jelzin, und persönlich Professor Wladimir Ja. ihren tiefsten Dank aussprechen. Shur, Direktor des Zentrums, für seine unschätzbare Unterstützung bei der Durchführung dieser Studie durch die Synthese von Suspensionen der untersuchten Nanopartikel. Wir danken auch den Mitarbeitern des Zentralen Forschungslabors der Ural State Medical University und persönlich Professor Oleg G. Makeyev für die Feststellung der genomischen DNA-Fragmentierung.

Medizinisches Forschungszentrum Jekaterinburg für Prophylaxe und Gesundheitsschutz bei Industriearbeitern, Popov-Straße 30, Jekaterinburg, Russische Föderation, 620014

Marina P. Sutunkova, Yuliya V. Ryabova, Ilzira A. Minigalieva, Tatiana V. Bushueva, Renata R. Sakhautdinova, Ivan A. Bereza, Daria R. Shaikhova, Anna M. Amromina, Aleksei I. Chemezov, Ivan G. Shelomencev & Lev A. Amromin

Labor für stochastischen Transport von Nanopartikeln in lebenden Systemen, Uraler Föderale Universität, Lenin Avenue 51, Jekaterinburg, Russische Föderation, 620000

Yuliya V. Ryabova und Ilzira A. Minigalieva

Ural State Medical University, 2 Repin Street, Jekaterinburg, Russische Föderation, 620014

Irene E. Etwas

Labor für mathematische Modellierung physikalischer und chemischer Prozesse in Mehrphasenmedien, Uraler Föderale Universität, 51 Lenin Avenue, Jekaterinburg, Russische Föderation, 620000

Liubov V. Toropova

Otto-Schott-Institut Für Materialforschung, Friedrich-Schiller-Universität-Jena, 07743, Jena, Germany

Liubov V. Toropova

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MPS, IAM, YVR konzipierten und gestalteten die Experimente. IAM, YVR, TVB, RRS, IAB, DRS, AMA, AIC, IGS, LAA, IEV führten die Experimente durch und analysierten die Daten. IAM, MPS, YVR, AIC, LAA, LVT haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren überprüften die Ergebnisse und genehmigten die endgültige Version des Manuskripts.

Korrespondenz mit Liubov V. Toropova.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sutunkova, MP, Ryabova, YV, Minigalieva, IA et al. Merkmale der Reaktion auf subchronische niedrigdosierte Exposition gegenüber Kupferoxid-Nanopartikeln bei Ratten. Sci Rep 13, 11890 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38976-z

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Eingegangen: 20. Dezember 2022

Angenommen: 18. Juli 2023

Veröffentlicht: 23. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38976-z

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